"…Es geht um eine bessere Wissenschaft…"
Eindrücke vom 10. Weltkongress in Seattle

Organisiert wurde der Kongress vom Institute for Risk Analysis and Risk Communication der Universität Washington gemeinsam mit der Environmental Protection Agency (EPA), dem Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT) der Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health und dem Alternative Congress Trust (ACT). Aufgabe des ACT ist es, Wissenschaftlern und der Öffentlichkeit Alternativen zum Tierversuch nahe zu bringen und für eine weite Verbreitung der neuen Methoden zu sorgen. Hauptgeschäftsführer des ACT ist Dr. Herman Koeter, allgemein bekannt als Leiter des Nationalen Ausschusses der Niederlande NCad, der sich im Dezember letzten Jahres mit dem Nationalen Plan zum Ausstieg aus dem Tierversuch im Bereich der Regulatorischen Toxikologie einen Namen gemacht hat.

Oben: Skyline von Seattle.
Foto: Christiane Hohensee

Ca. 700 Abstracts aus 43 Ländern waren eingereicht worden, darunter rund 350 Poster. Die Beiträge waren verteilt über neun verschiedene Konferenzthemen wie innovative Modelle für Sicherheits- und Wirksamkeitstestung, Systembiologie, Ethik, Translation und andere.

An dieser Stelle können nur ein paar Entwicklungsbeispiele vorgestellt werden.

Hautmodelle inzwischen weltweit angewandt

Ein großes Thema waren in-vitro-Modelle zur Untersuchung von hautreizenden Substanzen und allergischen Reaktionen. Während in Europa derart Modelle bereits Teil OECD-zugelassener abgestufter Testsysteme sind, wurde deren Prüfergebnisse für einen Einzug in die gesetzlichen Vorschriften in Brasilien oder China gerade berichtet. Ein Forscherteam hat in-vitro-Testergebnisse der EpiSkin-Niederlassung in China zur Hautreizung und -ätzung vorgestellt. Die EpiSkin-Hautmodelle werden dort wie in Europa in einer integrierten Teststrategie zur Bewertung toxikologischer Eigenschaften und für Kosmetiktests verwendet.

Die Modelle haben also ihren Siegeszug um den Globus angetreten. Dazu hat auch entschieden auch die kosmetische Industrie beigetragen, z.B. L`Oréal und Beiersdorf. L`Oréal war mit 23 Konferenz-beiträgen über Forschungskooperationen vertreten.

Es gab zudem Ergebnisse über eine Hautreizungsvalidierungsstudie und eine Studie zur Übertragbarkeit der OECD-zugelassenen Hautreizungstests auf Medizinproduktetests.

Gezüchtete Hautmodelle im Labor.
Foto: Christiane Hohensee


Konzerne an Entwicklung und Anwendung von Ersatzmethoden beteiligt

Viele Konzerne stellen ihre eigene Forschung auf dem Gebiet der Ersatzmethodenentwicklung vor oder geben einen kleinen Einblick in die Arbeit ihrer Labore. Allen voran natürlich LÒréal, das z.B. mit der University of Central Florida einen 4-Organ-Chips erfolgreich getestet hat.

Das französische Unternehmen EpiSkin war auf dem Weltkongress in Seattle selbst vertreten. Es bietet neben verschiedenen konstruierten Hautmodellen und Vollhautmodellen auch Augenhornhautmodelle, Mundschleimhautmodelle und Vaginalepithelmodelle für Reizungstests an. Das Augenhornhautmodell ist im Juli von der OECD nach sowohl einer Validierungsstudie der ECVAM als auch von Cosmetics Europe als EpiOcular Augenreizungstest (EIT) als Bestandteil einer integrierten Teststrategie (Nr. 263, ENV/JM/MONO(2017)15) zugelassen worden. Neu ist ein Zellmigrationstest mit humanen Corneaepithel-Zellen kokultiviert mit immunkompetenten Monozyten, deren Wanderung durch eine Membran sich beobachten lässt, wenn es auf der Epitheloberfläche zu Entzündungsprozessen gekommen ist. Damit sind die Möglichkeiten der in-vitro-Untersuchungen um den Endpunkt der Entzündungsprozesse erweitert worden.

BASF hat eine Methode zur Detektion von Stoffen vorgestellt, die allergische Hautreaktionen auslösen können. Mit der neuen Methode kann nun auch die Stärke der hautsensibilisierenden Wirkung eines Stoffes vorhergesagt werden. Das ist wichtig, weil Chemikalien nach GHS klassifiziert und gekennzeichnet werden müssen.

Aber auch das Multi-Technologieunternehmen 3M verfügt über ein Strategic Toxicology Laboratory, in welchem Produkte mit zahlreichen dreidimensionalen Humangewebe getestet werden. Dazu zählen neben Haut- und Augentestmodellen, auch orale, Lungen- und Vaginalgewebe.

Das Unternehmen Qualyst Transporter Solutions hat den sogenannten C-DILI Assay entwickelt, mit dem das potenzielle Risiko einer bestimmten Form von Lebertoxizität ermittelt werden kann, die durch eine Abflussstörung der Gallenflüssigkeit (cholestatisch) verursacht wird. Dabei werden Leberzellen in Sandwichkultur gezüchtet. Sie formen u.a. Gallentaschen, die Leberzellen bilden alle notwendigen Transporter aus. Die Lebertoxizität wird in Form eines prozentualen Anstiegs der Lactatdehydrogenase als Maß für die Leberzellverletzung gemessen.

Entwicklungen in der Inhalationstoxikologie

Verschiedene Forschergruppen aus Singapur, den USA und Österreich stellten Testergebnisse mit humanen Lungenzellkulturen, Kokulturen mit Immunzellen oder mit einem Lungensimulator  vor. Letzterer exponiert Latex- oder Schweinelungen mit Aerosolen. Alle Forscherteams halten ihre unterschiedlichen Modelle für geeignet, um lungenschädigende Chemikalien zu testen.
In eine Validierungsstudie gekommen ist inzwischen das Lung-on-a-Chip-Modell mit humanem Zellmaterial von Prof. Donald Ingber vom Wyss Institute für Biologically Inspired Engineering der Harvard Universität.




Foto mit Arosol und die Frage: wann können in der Inhalationstoxizität die Tierversuche abgelöst werden?
Foto: encierro, Fotolia.com

Ein sehr interessantes Modell als Ersatz für eine akute Inhalationsstudie am Tier stellte ein deutsch-luxemburgisches Wissenschaftlerteam um Prof. Brunhilde Blömeke von der Umwelttoxikologie Trier und Dr. Tommaso Serchi vom Luxembourg Institute of Science and Technology vor. Die Wissenschaftler arbeiten mit einem immunkompetenten humanen Lungenzellmodell. Eine früher bereits entwickelte Tetrazell-Kultur mit der Alveolarzell-Linie A549, differenzierten Dendriten-ähnlichen Zellen (THP-1), Mastzellen (HMC-1) und Endothelzellen (EA.hy 926) auf einer porösen Membran wurde hier um einen weiteren Immunzelltyp, die Makrophagen, ergänzt. Die Immunzellen bilden bestimmte Oberflächenproteine aus (CD54 und TSLPr) und setzen bestimmte Botenstoffe (Zytokine) frei, mit dessen Hilfe sich zuverlässig Lungen-reizende von allergischen Stoffen unterschieden lassen. Bislang gibt es für diese Fragestellung noch kein validiertes Modell.

Dr. Samuel Constant, Inhaber des Schweizer Unternehmens Epithelix, ist mittlerweile in der Lage, den gesamten menschlichen Respirationstrakt in-vitro abzubilden. Dafür werden Modelle des Nasenrachenraums, der Luftröhre, Bronchien und Bronchiolen (oberflächliche und tiefere Lungenschichten) miteinander kombiniert. Das System lässt sich für einen Zeitraum von sechs Wochen kultivieren.

Integrierte Teststrategien für die Inhalationstoxizität: die kollektiven Stärken der Testmethoden herausarbeiten

Dadurch, dass mit Tests zur akuten Inhalationstoxikologie sowohl lokale als auch systemische Untersuchungen durchgeführt werden müssen, hat das NICEATM gemeinsam mit dem PETA International Science Consortium (PISC) im September 2016 einen Workshop organisiert, deren Ergebnisse auf dem Kongress vorgestellt wurden. An dem Workshop am September 2016 war auch die amerikanische EPA und der Chemiekonzern Dow Chemicals beteiligt. Die Teilnehmer empfahlen, eine Datenbank mit bereits vorhandenen akuten systemischen Toxizitätsdaten aufzubauen, ein Review über aktuellste Toxizitätsmechanismen und Testmethoden für die akute Inhalationstoxizität zu verfassen, einen Entscheidungsbaum per Computer zu entwickeln, die in-vitro-Assays zu optimieren sowie Standardprotokolle für deren weltweite Anwendung in Laboren zu erstellen (1). Die derzeitigen Testguidelines für die Inhalationstoxizität seien lediglich Grundprinzipien, die Aufschluss über die wesentlichen Testbedürfnisse geben. Diese müssten nun durch alternative Ansätze und Möglichkeiten, vorhandene Informationen zu nutzen, angegangen werden, damit auf die erforderlichen Tests verzichtet werden kann. Eine Vielzahl an Alternativmethoden könnten bereits zuverlässig zytotoxische Substanzen identifizieren, aber mit einer einzeln durchgeführten Methode könnten die vielfältigen Mechanismen der akuten systemischen Inhalationstoxizität nicht beurteilt werden. Integrierte Test- und Bewertungsansätze werden daher benötigt. Integrierte Test- und Bewertungsansätze werden erforderlich sein, um die Bandbreite der verschiedenen Mechanismen sowie der relevanten Chemikalien abzudecken und die kollektiven Stärken der vielversprechendsten Testmethoden und Non-Testing-Ansätze nutzen zu können. Um damit erfolgreich zu sein bedarf es des Inputs aus Industriebranchen, akademischen Disziplinen, Bundesbehörden, Stakeholder-Organisationen und internationaler Organisationen.

Modelle der Entwicklungs- und Reproduktionstoxizität
 
Um die Auswirkungen von Umweltchemikalien auf die Nachkommen zu untersuchen, nutzen Wissenschaftler der EPA bereits in-vitro-Assays, die die Toxizitätsmechanismen in Zellen und Gewebe detektieren lassen, sowie Computervorhersageprogramme. Fortschritte wurden mit Modellen erzielt, die in der Lage sind, z.B. die Angiogenese (Gefäßentwicklung), die frühe Nierenentwicklung und z.B. die Palatogenese (Gaumenbildung) zu rekapitulieren. Mit den nächsten Schritten sind z.B. die Entwicklungsstadien der Neurogenese geplant, also wichtige Ereignisse in der Individualentwicklung. Alle Informationen sollen am Ende in einen virtuellen Embryo münden.

Eine Arbeitsgruppe um Prof. Elaine M. Faustman von der Seattle School of Public Health der Universität Washington um stellte eine dreidimensionale in-vitro-Kokultur vom Hodengewebe der Maus vor, um Substanzeinwirkungen auf einen sensiblen Entwicklungszeitraum zu untersuchen. Über einen längeren Zeitraum maßen sie die Zellviabilität von Sertoli-, Leydig- und Keimzellen sowie die Testosteronproduktion. Das Modell könne Signaltransduktionswege der Zellteilung, Steroidregulation und Spermatogenese bei der Entwicklung der männlichen Reproduktionsorgane untersuchen lassen. Ein ähnliches Ko-Kulturenmodell hat eine Forschergruppe der Universität Georgia unter der Leitung von Prof. Xiaozhong (John) Yu entwickelt. Sie halten ihr Modell für geeignet, um reproduktionsschädigende Substanzen zu screenen.

Eine italienische Forschergruppe um Prof.  Paolo Antonio Netti vom Istituto Nazionale Tumori IRCCS in Mailand hat ein humanes in-vitro Muttermund-Modell entwickelt. Die Forscher wollen damit die Zellinteraktionen zwischen Epithel und Stromagewebe untersuchen und neue Therapeutika testen.

Andere Gewebe auf Chip oder Mikrotiterplatte

Eine niederländische Gruppe um Dr. Stefan Vaessen von der  University of Applied Sciences Utrecht hat ein Modell der menschlichen Darmbarriere vorgestellt. Es besteht aus zwei Kompartimenten auf einem Chip. Ziel ist es u.a., Medikamentenabsorption, Verstoffwechslung in der Darmwand, Schleimhauteinflüsse und Hormoneinflüsse zu untersuchen.

Das amerikanische Unternehmen MatTek aus Ashland hat sich ebenfalls u.a. mit der Entwicklung eines Darmmodells beschäftigt. Das Gewebe stammte jedoch von Spendern. Sie konnten zeigen, wie sich das Gewebe nach einer Verwundung wieder selbst rekonstruiert. Laut Angaben der Entwickler können die Zellen bis zu 42 Tage kultiviert werden.

Prof. Thomas Hartung von der Johns Hopkins-Universität in Baltimore berichtete, dass den Hirnorganoiden, bestehend aus Nerven- und Gliazellen mittlerweile Immunzellen hinzugefügt werden konnten. Damit kann das Forscherteam entzündliche Entwicklungen von Gehirnfrühstadien untersuchen. Zudem entwickelt die Gruppe ein Krebs- bzw. Metastasen-Modell von Nervenzellen des Gehirns.

Multi-Organ-on-a-Chip: Erste Ergebnisse von Tests und Validierungsstudien

Ein weiteres, wichtiges Thema war die Multiogan-on-a-Chip-Technologie. Hierzu wurden Ergebnisse aus einer Vielzahl an Studienkooperationen zwischen Universitäten und der kosmetischen Industrie vorgestellt. Von Seiten der Industrie besteht ein großes Interesse an tierversuchsfreien Testmöglichkeiten für die Langzeittoxizität (repeated dose toxicity), nachdem in Europa seit 2013 keine Tierversuche zur Herstellung und Vermarktung von Kosmetika mehr durchgeführt werden dürfen.

Eine Arbeit war z.B. eine toxikokinetische Studie mit einem 2-Organ-Chip, indem sich ein Hautmodell und 3d-Leberorganoide befanden. Getestet wurde die zeitliche Änderung der Substanzkonzentration von all-trans-Retinsäure (Vitamin-A-Säure oder Tretinoin) in den beiden organähnlichen Systemen. Vitamin-A-Säure wird in der kosmetischen Industrie, aber auch in der Medizin z.B. zur Behandlung von Akne vulgaris verwendet (2). Die Substanz wurde einmalig und wiederholt lokal auf die „Haut“ und systemisch in das Leberkompartiment des Chips verabreicht. Mit den Stoffwechselanalysen konnten die Forscher die Funktionalität des Modells zeigen und wollen die Erkenntnisse zusammen mit anderen Untersuchungen bei ihren in-vitro-in-vivo Extrapolationsberechnungen berücksichtigen, denn in-vitro-Beobachtungen sind nicht ohne weiteres auf die in-vivo-Situation übertragbar.

Mit dem 4-Organ-Chip der University of Central Florida unter der Leitung von Prof. James Hickman können systemische Untersuchungen mit Herzmuskel- und Skelettmuskelgewebe sowie Nervenzellen und Lebergewebe über einen Zeitraum von 28 Tagen durchgeführt werden, indem der Einfluss von Substanzen durch elektrische und mechanische Herzfunktion, durchneuronale Aktivität, Muskelkontraktion, Leberenzyme, Albumin und Harnstoffkonzentration nicht invasiv gemessen werden. Das Multiorgan-on-a-Chip-Modell funktioniert ohne Pumpe, denn ein Problem bei den Multi-Organ-on-a-Chips und der Simulation der menschlichen Organphysiologie ist die behutsame Gestaltung eines „Blut“flusses oder einer anderen geeigneten Flüssigkeit. Pumpen üben einen derart starken Druck auf die Miniaturorgane aus, dass dies zu erheblichem Stress in den Zellen, zu einer Beschädigung und damit am Ende zu falschen Messergebnissen führen kann. Mit dem pumpenlosen System können physiologische Messungen vorgenommen werden, ohne die Zellviabilität zu beeinträchtigen. Die Arbeitsgruppe hat zudem ein Barriere-Organ-System, ein Nierenzellsystem mit proximalen Tubulizellen und ein Blut-Hirnschrankensystem entwickelt. Alle Zellkultursysteme sind humanen Ursprungs und frei von jeglichen Seren tierischen Ursprungs.

Saskia_Kliphus stellt die neue Datenbank mit tierserum-freien Medien, entwickelt von Animal-free Research UK und der Universiteit Utrecht, Faculty of Veterinary Medicine, vor.
Foto: Carolin Spicher.


Regulation und die Organ-on-a-Chip-Technologie: Welche Komplexität ist notwendig?

Die FDA sieht für eine mögliche Evaluierung von Organen auf dem Chip noch einige technische Herausforderungen. Eine mögliche Evaluation habe anwendungsbezogen stattzufinden. Daher wird der Anwendungsbereich in näherer Zukunft wird eher im Screening gesehen.

Die Regulationsbehörden wissen noch nicht, was die Multi-Organ-Chips taugen oder wie kompliziert ein Modell sein muss, z.T. nicht, was gefordert werden muss und ob, vielleicht einfache Systeme reichen. Es fehle die Information, wie Biomarker gemessen werden sollen und welche Biomarker gebraucht werden.

Prof. Hajime Kojima vom National Institute of Health Science in Tokio hat gerade mit der Lab-on-a-Chip-technologie begonnen und erwarte in Zukunft von der FDA eine Evaluation. Ob es möglich sei, dass diese Modelle für den regulatorischen Gebrauch genutzt werden können.

Prof. Bob van den Water als Sprecher des europäischen Projekts EU-ToxRisk wies darauf hin, dass dies genau das ultimative Ziel des Projekts wäre, die Frage zu beantworten, ob auch einfachere Zellmodelle die regulatorisch notwendigen Informationen beantworten könnten. Jedes Modell hätte zu zeigen, ob es die Humanphysiologie auch wirklich repräsentieren könne.

Prof. Spielmann von der Freien Universität Berlin warf ein, dass die Industrie solch eine Evaluierung wünsche.

Dr. Reyk Horland von TissUse betonte die Wichtigkeit von Qualitätsstandards. Die TissUse Assays seien arbeitsfähig und alle Beteiligten könnten damit ihre Fragen beantworten.

Die Ausweitung der Tissueentwicklung auf Tierorgane für den Vergleich mit in vivo-Tierversuchs-ergebnissen, wie von Dr. Warren Casey ins Spiel gebracht, sei nicht notwendig, weil genügend klinische Humandaten vorlägen.

Forscher der Universität Washington sprachen sich für komplexe Modelle aus, da die dadurch erzielte Vielzahl an Informationen wertvoll seien.

Allerdings, die Standardisierung der Phänotypen und Protokolle sei essenziell. Es gäbe weltweit so viele Protokolle in Labors.

Fazit:
Kritisch ist derzeit noch die Vergleichbarkeit der Ergebnisse der weltweit verteilten Labors und Forschungseinrichtungen. Es fehlt noch an einer Standardisierung für Zellen, Zuchtbedingungen, Medien usw. Forscher der Johns Hopkins University haben zudem die Charge einer kommerziell erhältlichen Adenokarzinomzelllinie der menschlichen Brust analysiert und eine bemerkenswerte phänotypische Heterogenität gefunden. Dies könnte, so schlussfolgerten die Autoren um Kleensang et al., (3) einen erheblichen Einfluss auf die Reproduzierbarkeit der Versuche haben. Die Erkenntnisse aus den Validierungsstudien der letzten Jahre gipfelten zudem in einem neuen Validierungsansatz: Entwicklungen und die Anerkennung von Methoden verlaufen nicht linear, sondern zirkulär, da während und nach dem Validierungsprozess häufig neue Fragen auftreten, die eine Verbesserung der Methode notwendig machen, (z.B. wenn die Testmethode auch für andere Substanzen nutzbar sein soll, die noch nicht Gegenstand der Validierung waren o.ä.).

Weitere Informationen:
(1) https://ntp.niehs.nih.gov/pubhealth/evalatm/test-method-evaluations/acute-systemic-tox/acute-inhalation-toxicity/index.html
(2) http://flexikon.doccheck.com/de/Tretinoin
(3) Kleensang, A., Vantangoli, M. M., Odwin-DaCosta, S., Andersen, M. E., Boekelheide, K., Bouhifd, M., Fornace Jr, A. J., Li, H.-H., Livi, C. B., Madnick, S., Maertens, A., Rosenberg, M., Yager, J. D., Zhao, L. & Hartung, T. (2016): Genetic variability in a frozen batch of MCF-7 cells invisible in routine authentication affecting cell function. Scientific Reports 6, Article number: 28994. doi:10.1038/srep28994. https://www.nature.com/articles/srep28994.

Kongressabstactband:
http://www.altex.ch/altex-proceedings/wc-10-seattle