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Donnerstag, 21 April 2016 07:00

Arbeitsgruppe im Portrait: Institut für Stammzellforschung und Regenerative Medizin, Düsseldorf

InVitro+Jobs stellt regelmäßig Wissenschaftler und ihre innovativen Forschungen als „Arbeitsgruppe im Portrait“ vor. Im Fokus stehen neu entwickelte Methoden, ihre Evaluation sowie der Ausblick, welche tierexperimentellen Versuchsansätze gemäß dem 3R-Prinzip (reduce, refine, replace) nach Möglichkeit reduziert und bestenfalls ersetzt werden können.

An dieser Stelle stellen wir ein Institut vor, das sich unter anderem mit der Entwicklung von Krankheitsmodellen in der Petrischale (diseases-on-a-dish) beschäftigt. Die Modelle ermöglichen die Erforschung von Krankheitsentwicklungen auf Basis Patienten-spezifischer humaner Zellen statt auf Basis von genetisch veränderten Tieren (Tiermodelle).

Arbeitsgruppe im Portrait:
Institut für Stammzellforschung und Regenerative Medizin
an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf


Leiter des Instituts ist der Biochemiker und Molekularbiologe Prof. Dr. James Adjaye. Er hat lange Jahre in Großbritannien gearbeitet und sich dann am Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik in Berlin auf die molekulare Frühentwicklung und die Stammzellforschung spezialisiert.

Prof. Adjaye ist seit Mai 2012 Direktor des Instituts für Stammzellforschung und Regenerative Medizin (ISRM) an der Medizinischen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. Hier entwickelt sein Wissenschaftlerteam einen systembiologischen Ansatz, um sowohl die normale Entwicklung von Leber und Nervensystem zu verstehen, aber auch Alterungsprozesse und Krankheitsmechanismen, zu denen neben der Alzheimer-Erkrankung z.B. die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung gehört.

Er war außerdem lange Jahre Leiter der Gruppe Molekulare Embryologie und Alterung am Max-Planck- Institut für Molekulare Genetik in Berlin und Projektkoordinator des transnationalen Forschungskonsortiums Projekts ERASysBio Plus. 16 Projekte aus 13 Ländern waren hier miteinander verknüpft, um mathematische Modelle und Vorhersageprogramme zu entwickeln (1). Eines dieser Programme befasste sich mit der Erforschung der nicht-alkoholischen Fettleber. ERASysBio Plus wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung unterstützt.


Fettlebererkrankungen: in Industriegesellschaften sehr weit verbreitet


Der Anteil der Fettleibigen in der Weltbevölkerung ist auf dem Vormarsch*: In einer aktuellen Studie, publiziert im renommierten Journal The Lancet, wird hochgerechnet, dass bis 2025 das globale Übergewicht einen Anteil von 18 Prozent bei den Männern und 21 Prozent bei den Frauen erreicht haben wird (2). Mit dem Anteil der Adipösen steigt auch der Anteil derer, die unter einer Fettlebererkrankung leiden könnten, wobei die Entstehungsursachen oft komplizierter sind (3). Nach neueren Schätzungen sollen in den westlichen Industriegesellschaften, bedingt durch einen sitzenden Lebensstil sowie eine zu fettreiche Ernährung, annähernd 30 Prozent der Bevölkerung eine Fettleber aufweisen (4).

Auch andere Erkrankungen können zu einer Fettleber führen (sekundäre Steatosis hepatis, 5). Ursache kann ein schlecht eingestellter Diabetes, eine Fettstoffwechselerkrankung, die auf eine Störung der Lipoproteinsynthese1 zurückzuführen ist, eine Hepatitis C-Virusinfektion, aber auch eine Mangelernährung sein (6, 5). Bei den genetischen Faktoren können z.B. Genveränderungen für die Proteine PNPLA3 und TM6SF2 eine Rolle spielen (7). In einem Fall führt ein einzelner Austausch einer Aminosäure in dem Protein PNPLA3 zu einer Prädisposition für eine ernsthafte Fettlebererkrankung. Das Protein reguliert im Normalfall den Lipidstoffwechsel im Leber- und Fettgewebe (8). Ähnlich verhält es sich mit dem Protein TM6SF2, das in Leber und Darm vorkommt und ebenfalls eine Funktion beim Fettstoffwechsel hat (9).





 
Die Entwicklung einer Fettleber zeigt im Vergleich zur gesunden Leber deutliche Fettablagerungen, meist aus Triglyzeriden.
Foto: Joshya, Fotolia.com


Kennzeichen einer nicht-alkoholischen Fettleber sind Anhäufungen von Lipiden (vor allem Triglyzeriden) in den Leberzellen. Bei einer geringgradigen Fettleber ist bis zu 33 Prozent des Leberspeichergewebes von Fetteinlagerungen betroffen, bei einer hochgradigen dagegen mehr als 66 Prozent. Ohne Fibrose2 und Entzündung ist die Fettlebererkrankung reversibel (5).

Die Fettlebererkrankung soll für 10-20 Prozent aller Zirrhosen3 und Formen des hepatozellulären Karzinoms (Leberkrebs, HCC) in den westlichen Industriegesellschaften verantwortlich sein (5).
 




Verschiedene Stadien der Lebererkrankung: Während man bei der gesunden Leber keinerlei Anhäufung von Lipiden sieht (1. Bild), ist die Leber bei der Steatose bereits mit Lipidanhäufungen übersäht (rechts oben zweites Bild). Die Steatose ist ohne äußere Komplikationen, das Risiko eines Herzinfarkts ist jedoch erhöht (4). Dieses Stadium ist noch reversibel, im Gegensatz zur Leberfibrose (3. Bild links unten). In diesem Stadium kommt es nach Entzündungsprozessen zu Vernarbungen, bestehend aus Bindegewebe (blau eingezeichnet). Endstadium ist die Leberzirrhose (Schrumpfleber, rechts unten), die ihre Funktion zunehmend nicht mehr ausüben kann, weil das ehemalige Speichergewebe (Parenchym)  in funktionsloses Bindegewebe umgewandelt worden ist.
Foto: Peter Junaidy, Fotolia.com



Nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFD)

Unter einer nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung versteht man eine Verfettung der Leber mit einem Fettanteil von 5 bis 10 Prozent des Lebergewichts, die nicht auf einen erhöhten Alkoholkonsum zurückzuführen ist. Wissenschaftler haben geschätzt, dass in der Allgemeinbevölkerung weltweit ca. 20-30 Prozent von einer NAFD betroffen sind (5).

Zu den nicht-alkoholischen Fettlebererkrankungen zählen eine Vielzahl von Erkrankungen, die von einer Fettleber ohne ein Entzündungsgeschehen und ohne nennenswertes Fortschreiten der Erkrankung bis zur nicht- alkoholischen Fettlebererkrankung mit Entzündungen und Leberzellschäden (Steatohepatitis) mit der Folge einer starken Vermehrung von Bindegewebe und folgender Vernarbung (Fibrose) reicht. In bestimmten Fällen kann sich aus einer Leberfibrose eine Leberzirrhose entwickeln, bei der es zur Schrumpfung der Leber und zur Zerstörung von Lebergewebe kommt. Man nimmt an, dass bis zu 0,3 Prozent der Allgemeinbevölkerung eine Leberzirrhose ausbildet. Leberkrebs kann ebenfalls die Folge sein.

Zu einer nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung können Stoffwechselstörungen, Fettleibigkeit, ein schlecht eingestellter Diabetes mellitus, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen, aber auch Medikamentennebenwirkungen führen (3, 10).


 
Es fehlt bislang jedoch noch eine Risikoklassifizierung der Erkrankung. Dazu müssen die Bedingungen bekannt sein, die die Erkrankung negativ beeinflussen (11). Daher wollen die Wissenschaftler mit ihrem Modell die Mechanismen der Entstehung und des Fortschreitens der Erkrankung aufspüren. Dafür identifizieren sie geeignete Biomarker und - nach Auswertung von Genom-weiten Assoziationsstudien (GWAS)4 - neue Diagnosetools für die Fettlebererkrankung (4).


Induzierte pluripotente Stammzellen: von der Körperzelle zum Krankheitsmodell in der Petrischale

Zur Untersuchung dieser durch vielfältige Faktoren verursachte Lebererkrankung gibt es sowohl Tiermodelle (10) als auch Zellkulturmodelle in der Petrischale, sogenannte disease-on-a-dish-Modelle. Jedoch lassen sich, bedingt durch die Unterschiede in den Krankheitsphänotypen zwischen Mensch und Tier, die Forschungsergebnisse am Tier nicht immer zuverlässig auf die menschliche Situation übertragen.

Zwar gibt es Tiermodelle, an denen eine Fettlebererkrankung untersucht wird. Sie können aber das Geschehen nicht wirklich abbilden, weil die Ursachen so vielfältig sind und in den Tieren nur über zwei Faktoren künstlich erzeugt werden können.

Zwar wurden verschiedene Mausmodelle entwickelt, aber keines spiegelt die Entwicklung des krankhaften Umbaus (Histopathologie) des Lebergewebes und die damit verbundenen Funktionseinbußen bei Stoffwechselprozessen (Pathophysiologie) der humanen nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung vollständig wider (10). Z.B. nutzen Forscher spontane Mutationen im Leptin-Gen von Mäusen, ein Hormon, das im weißen Fettgewebe produziert wird. Dadurch zeigen die Tiere extreme Fettleibigkeit, Insulinresistenz und erhöhte Insulinspiegel, aber keine Steatohepatitis, d.h. sie haben eine Fettleber, es entwickeln sich jedoch spontan keine zusätzlichen entzündlichen Veränderungen wie sie sich beim Menschen entwickelt. Andere Tiermodelle entwickelten eine Leberfibrose, wenn die Tiere zusätzlich zu ihrer Mutation noch mit einer Diät ernährt wurden, die ihnen die essenzielle Aminosäure Methionin und das Vitamin-ähnliche Cholin vorenthielt (10). Beim Menschen ist z.B. die Aufnahme von Cholin nicht unbedingt notwendig, solange er über die Nahrung Methionin und Folsäure aufnimmt (12).

Wichtige Mechanismen der Entstehung von Fettlebererkrankungen können als Ersatz zum Tierversuch auch in der Petrischale untersucht werden. Im Berliner Max-Planck-Institut für molekulare Genetik züchtete der Stammzellforscher Prof. James Adjaye 2008 die ersten deutschen indizierten pluripotenten Stammzellen (iPS). Es ist die ethische Lösung für die Nutzung menschlicher Stammzellen, denn die Verwendung humaner embryonaler Stammzellen gilt in Deutschland als moralisch bedenklich.


Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen

Zur Herstellung von iPS-Zellen braucht man nur eine kleine, z.B. nicht-invasiv erworbene Zellprobe, z.B. von der Haut, aus dem Nabelschnurblut oder aus dem Urin. Invasiv können Zellen aus dem Knochenmark gewonnen werden. Bei den bisherigen Verfahren war es zur Reprogrammierung notwendig, dass die vier bestimmte Gene (Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4) in die jeweilige Zelle eingeschleust werden (nach Takajashi & Yamanaka 2006, 13, 14). Viren dienten hierbei als Vehikel zum Einschleusen der Gene, die in das Erbgut der Zelle selber eindringen und es verändern. Die Veränderung des Erbguts kann jedoch zu genetischen Anomalien führen und sogar zu einem erhöhten Krebsrisiko führen (15). Verschiedene Forschungsgruppen arbeiten jedoch intensiv an Möglichkeiten, die beschriebenen Probleme zu lösen.
 
 

Körperzellen des Menschen, z.B. Hautzellen, mesenchymatische Stromazellen5 oder Zellen aus Nabelschnurblut lassen sich reembryonalisieren und dann in den gewünschten Zelltyp entwickeln. Bei den bisherigen Verfahren wurden vier bestimmte Gene (Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4) in die jeweilige Zelle eingeschleust. Viren dienten hierbei als Vehikel zum Einschleusen der Gene, die in das Erbgut der Zelle selber eindringen und es verändern. Die Veränderung des Erbguts kann jedoch zu genetischen Anomalien führen. Eine fortgeschrittenere Methode ist es, bestimmte biotechnologisch erzeugte Proteine in die Zellen einzubringen, und sie damit zur Reprogrammierung zu bringen. Inzwischen konzentrieren sich die Forscher auf die sogenannten Chromatin-Regulatoren. Damit lässt sich die Zellausbeute erhöhen und der Produktionszeitraum von iPS-Zellen von neun auf vier Tage reduzieren. Nach Reprogrammierung lassen sich die Zellen dann in den gewünschten Zelltyp differenzieren, in Nerven- oder Muskelzellen, Blut- oder Knochenzellen. Somit lassen sich Zellen und sogar Organ-ähnliche Gebilde erzeugen, die nicht nur human-spezifisch sind, sondern auch die genetische Information eines Patienten tragen.
Foto: chombosan, Fotolia.com


Eine fortgeschrittenere Methode ist es bislang, nicht mehr die Gene zu verändern, sondern bestimmte biotechnologisch erzeugte Proteine in die Zellen einzubringen (sogenannte Protein-induzierte pluripotente Stammzellen, 16) oder es werden sogenannte small molecules genutzt. Es sind kleinste Moleküle (bis 800 g/mol), die aufgrund ihrer geringen Größe in die Zellen eindringen können. Sie sind keine Proteine, können aber an Rezeptoren binden und Signalkaskaden in Gang setzen oder unterbrechen (16, 17). Andere Forscher sind überzeugt, den Zell-eigenen Schalter zur Reembryonalisierung gefunden zu haben. Dabei konzentrieren sich die Forscher nun auf die sogenannten Chromatin-Regulatoren, das sind Faktoren, die für das epigenetische Gedächtnis der Zellen zuständig sind. (Eine zelleigene Genregulation sorgt dafür, dass nicht alle Gene in einer Zelle abgelesen und umgesetzt, sondern ein Teil stillgelegt wird). Unter allen 615 Faktoren, die ein innovatives Forscherteam testete, schienen vier Faktoren eindeutig für die Aufrechterhaltung der Differenzierung der Zellen verantwortlich zu sein und die Bildung von iPS-Zellen zu verhindern. Die vier Faktoren werden SET domain-containing H3K9 methyltransferase (Setdb1), CHAF1A und CHAF1B, die den chromatin assembly factor 1-Komplex bilden sowie ubiquitin conjugating enzyme 2I genannt (18). Wenn diese Faktoren in Kombination unterdrückt wurden, erhielten die Wissenschaftler in Kultur eine 50- bis 2000-fach höhere Ausbeute an iPS-Zellen als mit nur einem Faktor. Durch die neue Entdeckung konnte der Produktionszeitraum von iPS-Zellen zudem von neun auf vier Tage reduziert werden (19).




Klassische Methode der Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen.
1. Bilden einer Zellkultur von somatischen Zellen, 2. Einbringen der Pluripotenzgene in die Zellen durch einen Retrovirus-Vektor. Zellen, die die Informationen der exogenen Gene aktiv umsetzen, sind rot eingezeichnet. 3. Ernten und Kultivieren der Zellen unter Verwendung von "Fütterzellen" (Zellen des Bindegewebes, sogenannte Fibroblasten (grau)). 4. Ein kleiner Teil der Zellen (rot) wird zu iPS-Zellen.
Schema: Y tambe, Wikipedia.


Aus iPS-Zellen hergestellte humane Leberzellen und Herzzellen sind derzeit geeignet, um z.B. toxische Wirkungen von Arzneimittelkandidaten zu testen (Screening). Da kardiotoxische Arzneimittel nicht weiterentwickelt werden, könnten ungeeignete Substanzen von vornherein aussortiert und müssen erst gar nicht an Tieren getestet werden (Reduktion von Tierversuchen).

Durch ihre Humanspezifik lassen sich die gewonnenen Zellen aber auch nutzen, um Patienten- spezifischere therapeutisch wirksame Substanzen zu finden und deren Funktionsmechanismus zu untersuchen (20). iPS-Zellen werden derzeit bereits in klinischen Studien als Zellersatztherapien bei altersbezogener Makuladegeneration (Erkrankung der Netzhaut des Auges, die zum Sehverlust führen kann) eingesetzt (21).

Ein Einsatzbereich der Zukunft könnte die Zucht patienteneigener Organe sein, mit der einem Mangel an Spenderorganen begegnet werden kann.


 

A: Humane embryonale Stammzellen (hESCs) und B: davon abgeleitete Nervenzellen.
Foto: Nissim Benvenisty.



Erfolg der Pluripotenz der Zellen muss nicht mehr mit dem Teratomtest überprüft werden

Bis vor kurzem testeten die Wissenschaftler an Mäusen, ob die Zellen wirklich die gewünschten Pluripotenzeigenschaften aufwiesen. Pluripotenz bedeutet, dass sich die Zellen in alle drei Keimblätter, Endoderm, Mesoderm und Ektoderm weiterentwickeln lassen, aus denen alle Organe hervorgehen. Dabei werden die zu überprüfenden Zellen den Mäusen unter die Haut gespritzt. Wenn sich dort ein Tumor - ein sogenanntes Teratom - bildet, in dem sich alle drei Keimblätter nachweisen lassen, gelten die Zellen als pluripotent. Es werden meist immundefiziente Mäuse unter sterilen Bedingungen eingesetzt, die nicht nur in, sondern bereits vor den Versuchen großem Leid ausgesetzt sind (22). Bei einer gründlichen Untersuchung können dabei 50-100 Mäuse pro Versuch eingesetzt werden. Es gibt keine einheitlichen Kriterien für die Testdurchführung (23). Das Ergebnis kann nur von einem hochspezialisierten Pathologen gewährleistet werden.

Für die Überprüfung der Pluripotenz der humanen Stammzellen gibt es einige tierversuchsfreie Ersatzverfahren zum Teratomtest, die aber alle nicht gleich gut geeignet sind. Sie sind zudem preiswerter und schneller als der Teratomtest. Z.B. gibt es einen Nachweis der aktiven Pluripotenzgene durch Untersuchung von DNA-Methylisierungsmustern, durch den Nachweis von Markerproteinen (geeignet für einzelne Fragestellungen) oder z.B. durch den Nachweis einer gerichteten Differenzierung in Zellen der drei Keimblätter. Für den Nachweis der Pluripotenz von iPS von Tieren gibt es noch einige andere Testalternativen. Möglicherweise haben sie sich als nicht so zuverlässig erwiesen.

Favorisiert in der Arbeitsgruppe von Prof. Adjaye wird der PluriTest (23).

Es handelt sich hierbei um einen Bioinformatik-Assay, der die Daten aus Genexpressionsprofilen zur Bewertung der Pluripotenz auf Basis humaner induzierter pluripotenter Stammzellen sowie nicht pluripotenter Zellen verwendet. In einer Datenbank befinden sich rund 450 Genexpressionsdatensätzen (SCM2-Datenbank). Die Daten sind mit Microarrays von unzähligen Stammzellpräparationen der unterschiedlichsten Labore erzeugt worden. Auch Genexpressionen differenzierter Zelltypen bzw. von sich entwickelndem oder ausdifferenzierten menschlichen Geweben sind enthalten. Unter den Datensätzen sind Stammzell-Expressionsprofile sowohl von humanen embryonalen Stammzellen als auch von induzierten pluripotenten Stammzelllinien.



 

Beispiel der Ergebnisse einer DNA-Microarray-Untersuchung. Je heller ein Punkt, desto mehr messenger-DNA für ein bestimmtes Gen wurde in der Zellprobe produziert. Mit dieser Art von Genchips werden Genexpressionsprofile erzeugt, die u. a. Grundlage für den PluriTest sind.
Foto: Mangapoco.



Zunächst vergibt das Programm eine Pluripotenz-Punktzahl, mit der für alle Abfrageproben und die bereits enthaltenen Genexpressionsprofile klassifiziert und in pluripotent und nicht-pluripotent unterschieden werden können. Dann werden Rangfolgen ermittelt, die sich aus der Übereinstimmung der Anzahl an Metagenen mit bereits bekannten pluripotenten bzw. nicht-pluripotenten Proben ergibt. Die Punktzahl wird aus einem mathematischen Regressionsmodell ermittelt. Der zweite Rechenvorgang besteht aus einem nicht-negativen Matrix-Faktorisierungsmodell (NMF-Modell),  das einem Tool mit einer Anzahl Algorithmen aus der multivariaten Statistik und der linearen Algebra entspricht (24).



Systembiologie - notwendige Hilfe mit dem Rechner

Da biologische Prozesse äußerst komplizierte Vorgänge sind, bei denen sich eine Vielzahl an Komponenten gegenseitig beeinflusst, können viele Fragen mit Methoden der klassischen Biologie nicht (mehr) beantwortet werden. Außerdem kann auch die Fülle von Daten, die weltweit mit unzähligen Messungen erzeugt werden, nur noch mit Hilfe leistungsfähiger Computer ausgewertet und damit nutzbar gemacht werden.

Mit der Systembiologie werden daher Methoden aus Biologie, Mathematik, Computerwissenschaften, Physik und Ingenieurwissenschaften miteinander verknüpft und zunächst als Hypothesen mathematische Modelle entwickelt, die dann immer wieder mit neuen Daten überprüft und weiterentwickelt werden. Aus aufkommenden wissenschaftlichen Fragen lassen sich neue naturwissenschaftliche Experimente ableiten (25).


Wir befragten den Stammzellspezialisten Prof. Dr. Adjaye zu seiner Arbeit und zum gegenwärtigen Stand der Forschung an induzierten pluripotenten Stammzellen.


InVitro+Jobs: Sie haben eine längere Zeit am Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik in Berlin gearbeitet: Kann man sagen, dass Sie einer der ersten Entwickler von induzierten pluripotenten Stammzellen in Deutschland waren?

Prof. Adjaye: Von 2001 bis 2014 war ich Gruppenleiter am Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik in Berlin. Ja, das ist richtig. Mein Labor war eines der ersten Gruppen in Deutschland, die induzierte pluripotente Stammzellen, die von somatischen Zellen abstammten, publiziert hatte.


InVitro+Jobs: Sind mittlerweile alle wesentlichen Hindernisse bei der Reprogrammierung von iPS-Zellen überwunden?

Prof. Adjaye: Es sind Reprogrammierungs-Protokolle Routine geworden, die ohne Retro-6 oder Lentiviren7 arbeiten. Einige Labore nutzen noch Sendai-Viren8, jedoch verwenden wir nicht-integrative Plasmide9 und das funktioniert gut.


InVitro+Jobs: Mit welchen Schwierigkeiten muss man heute rechnen?

Prof. Adjaye: Reprogrammierungs-Protokolle, die auf messenger-RNA basieren, sind noch eine echte Herausforderung.


InVitro+Jobs: Ist denn der genaue Mechanismus der Reprogrammierung von iPS-Zellen inzwischen bekannt?

Prof. Adjaye: Ja, eine Menge ist bereits bekannt, jedoch liegt der Fokus inzwischen auf dem Verständnis, wie sich Chromosomen-Abberationen10 in iPS-Zellen bilden, was insbesondere dann vorkommt, wenn induzierte pluripotente Stammzellen aus Spenderzellen älterer Personen entwickelt werden. Dies ist ein sehr wichtiges Thema, vor allem, weil iPS-Zellen in Zukunft routinemäßig in der zellbasierten Therapie genutzt werden sollen.


InVitro+Jobs: Viele Wissenschaftler arbeiten mit Tiermodellen: Was überzeugt Sie, dass iPS-Zellmodelle der richtige Weg sind? Welche bedeutende Rolle spielen iPS-Zellen bei der Entwicklung von neuen Methoden zum Ersatz von Tierversuchen?

Prof. Adjaye: Der offensichtliche Vorteil der iPS-Technologie ist, dass wir Humanerkrankungen studieren können. Und das ist sehr wichtig, weil es Unterschiede in den Krankheitsphänotypen zwischen Mensch und Tier gibt. Wir können die Forschungsergebnisse am Tier nicht immer zuverlässig auf die menschliche Situation übertragen.
 
InVitro+Jobs: Warum untersuchen Sie z.B. den Mechanismus der nicht-alkoholischen Fettleber in-vitro? Was sind die Vorteile dieses Modells in der Petrischale im Vergleich zum Fettleber-Tiermodell?

Prof. Adjaye: Die Nicht-alkoholische Fettleber ist eine leise Epidemiologie des 21 Jahrhunderts. Eine von drei Personen in den westlichen Industriegesellschaften ist fettleibig und es wird geschätzt, dass ungefähr 30 Prozent dieser Population an einer nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung leidet.

Da die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung außerdem eine Lifestyle-Erkrankung ist (durch eine zu fettreiche Ernährung und ein Fehlen ausreichender Bewegung) und es Unterschiede in der Empfindlichkeit zwischen einzelnen Personen gibt (manche Menschen ernähren sich fettreich, sind aber nicht fettleibig) muss also eine genetische Komponente beteiligt sein.

Aus all diesen Gründen ist die auf iPS-Zellen basierende Untersuchung geeigneter, da wir über Hautzellen (die wir in iPS-Zellen umwandeln), aber auch über Serum und klinische Daten unserer Patienten verfügen, damit wir ein besseres Verständnis des Erkrankungsmechanismus gewinnen können. Durch die Verwendung von iPS-Zellen können wir außerdem diese Erkrankung in vitro erzeugen, indem wir die Zellen in Hepatozyten differenzieren und dann eine Steatose induzieren, indem wir Ölsäure auf die Zellkultur geben und dann die Molekülereignisse downstream11 analysieren, wie z.B. die Genregulation und krankheitsbedingte Veränderungen der Signaltransduktionswege12.


InVitro+Jobs: Glauben Sie, dass in-vitro-Krankheitsmodelle geeignet sein werden, um den Tierversuch in ferner Zukunft abzulösen, vielleicht in Kombination mit Human-on-a-Chip-Modellen13?

Prof. Adjaye: Ich denke nicht, dass ein vollständiger Ersatz des Tierversuchs möglich ist. In-vitro-Modelle können jedoch helfen, Tierversuche zu reduzieren und zu verfeinern und natürlich sind auch Human-on- a-Chip-Modelle hilfreich auf diesem Gebiet.


InVitro+Jobs: Wir beurteilen Sie die Nutzung von fötalem Kälberserum in der Stammzellforschung?

Prof. Adjaye: Wir verwenden kein fötales Kälberserum wegen der damit verbundenen Probleme mit unbekannten bzw. nicht definierten Faktoren sowie batch-to-batch14-Variationen.


InVitro+Jobs: Wie beurteilen Sie den PluriTest - die Alternative zum Teratom-Assay mit Mäusen?

Prof. Adjaye: Er ist absolut geeignet. Wir führen den Teratom-Assay nicht mehr durch, sondern nutzen den EB-Assay15 in-vitro und dann den PluriTest.


InVitro+Jobs: Kennen Sie noch andere Ersatzmethoden für den Teratom-Test?

Prof. Adjaye: Lediglich der PluriTest ist zuverlässig.


InVitro+Jobs: Können Sie etwas über den Embryoid body15-Assay sagen, der zur Identifizierung der Pluripotenz genutzt wird? Ist es inzwischen möglich, Pluripotenz mittels small molecules zu erzeugen?
 
Prof. Adjaye: Wie versuchen uns daran gerade. Vor ein paar Jahren gelang es uns, die Pluripotenz mit Hilfe von Zellen der Amnionflüssigkeit des 1. Schwangerschaftstrimesters zu erzeugen, dies sind sehr junge Zellen und schwer zu erhalten. Bislang hat noch niemand erfolgreich und reproduzierbar iPS-Zellen aus somatischen Zellen erzeugt, indem er ausschließlich small molecules eingesetzt hat. Ich glaube nicht, dass das unmöglich ist, wir arbeiten gerade intensiv daran.


InVitro+Jobs: Wieviel Mitarbeiter arbeiten in Ihrem Labor?

Prof. Adjaye: Derzeit sind es 15 Mitarbeiter, es werden zukünftig aber noch weitere erwartet.


InVitro+Jobs: Bieten Sie Abschlussarbeiten und Stellen in der Stammzellforschung an?

Prof. Adjaye: Ja, sicher, für begabte Studenten.


InVitro+Jobs: Vielen Dank für das Gespräch.



* Untersucht durch die Erfassung des Body-Mass-Index (BMI)



Glossar:

1 Lipoproteinsynthese: Nicht-wasserlösliche Fette binden sich an Eiweiße, es entstehen Lipoproteine, die für die Fettverdauung die Lipide im Blut transportiert werden.

2 Fibrose: Entzündungsprozesse führen zu Vernarbungen aus Bindegewebe im Gewebe.

3 Leberzirrhose:   Schrumpfleber.   Das ehemalige Speichergewebe   hat   sich   in   funktionsloses   Bindegewebe umgewandelt.

4 Genom-weite Assoziationsstudien (GWAS): Hierbei wird das Erbgut einer großen Stichprobenzahl an Patienten mit dem Erbgut gesunder Menschen verglichen und zwar an den jeweils relevanten DNA-Positionen.

5 mesenchymatische Stromazellen: Stütz- und Hüllgewebe (Bindegewebe), aus dem sich nach Reprogrammierung knochenbildende Zellen, Knorpel- und Fettzellen entwickeln können.

6 Retroviren: RNA-Virus mit reverser Transkriptase. Nach Eindringen der RNA in Wirtszelle wird die RNA mit Hilfe dieses Enzyms in doppelsträngige DNA umgeschrieben. Ein viruseigenes anderes Enzym (Integrase) bildet eine Schleife, an deren Enden sich eine überhängende OH-Gruppe befindet. Diese greift an dem Zielchromosom der Wirtszelle an, wodurch die Virus-DNA in das Wirtschromosom eingebaut werden kann. Verbleibende Schäden der Wirts-DNA werden mit dem wirtseigenen Reparaturenzym beseitigt.

7 Lentiviren: Einzelstrang-RNA-Virus. Können auch Zellen infizieren, die sich nicht teilen, wie z.B. Nervenzellen.

8 Sendai-Viren: Das Sendai-Virus ist das Parainfluenza-Virus, Typ 1, der Maus. Es ist ein einzelsträngiges RNA-Virus und benötigt für seine Vervielfältigung keine DNA-Phase. Daher kann bei der Verwendung zur Erzeugung von iPS- Zellen das Aufschneiden des Genoms der Wirtszellen vermieden werden (26).

9 nicht-integrative Plasmide: Plasmide, die sich nicht in das Genom der Zellen einbauen.
 
10 Chromosomen-Abberationen: Strukturelle Veränderung von Chromosomen oder Chromatiden, z.B. durch Erhöhung der Anzahl von Chromosomen (numerische) oder Veränderung der Form durch Abbruch oder fehlerhaftes Zusammenfügen von Chromosomenstücken (strukturelle Abberation). Es kann zu Deletionen oder Inversionen von Stücken kommen oder z.B. zu Ringbildungen.

11 downstream: Begriff aus der Biochemie. Zellreaktionen auf einen Reiz laufen über eine Signalkaskade ab, indem außerhalb der Zelle der Reiz über einen Rezeptor aufgenommen und über verschiedene Zellprozesse wie Änderung von Konfigurationen von Molekülen oder z.B. Bindung kleiner Moleküle wie Phosphatgruppen der Reiz so lange weitergeleitet wird, bis er im Zellkern ankommt und dort an der DNA z.B. ein/mehrere Gene für die Herstellung eines Proteins o.ä. abgelesen wird. Damit oder mit anderen Prozessen reagiert die Zelle auf den Reiz. Den Beginn der Kaskade wird als Upstream, der Ablauf weiter unten wird als Downstream bezeichnet.

12 Signaltransduktionsweg: siehe downstream

13 Human-on-a-Chip-Modellen: Es ist das erklärte Ziel einiger Wissenschaftler, bis 2018 alle mindestens 10 menschliche Organe in miniaturform auf einem Mikrochip vereinigt zu haben und mit diesem Miniaturorganismus viele Tierversuche ablösen zu können.

14 batch-to-batch-Variation: Durch die Verwendung nicht genau charakterisierter Medien kann es zu einer Chargenstreuung (Variation der Messergebnisse) kommen, was verhindert werden soll (27).

15 EB-Assay (Embryoid Body-Assay). Der Embryoid Body-Assay ist im Gegensatz zum Teratomtest an der Maus ein in- vitro-Assay, der die Fähigkeit der Zellen zur Zellaggregierung testet, wenn die Stammzellen ohne Kontakt zu einer Oberfläche kultiviert werden. in einer kugeligen Form rekapitulieren sie begrenzt die Embryonalentwicklung, indem sie einzelne Zellen in jeden Gewebetyp (Zellen des Mesoderms, hämatotoetische und Endothelzellen, Muskelzellen und neuralen Zelllinien) ausbilden. Leahy et al. haben 1999 z.B. für die Identifizierung die frühe Expression von Markergenen vorgeschlagen (28) (Beschreibung des Teratomtests im Text).



Literatur und Quellen:

(1) https://www.erasysbio.net/index.php?index=263
(2) NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC) (2016): Trends in adult body-mass index in 200 countries from 1975 to 2014: a pooled analysis of 1.698 population-based measurement studies with 19,2 million participants. Lancet 387: 1377–96.
http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140- 6736%2816%2930054-X/fulltext
(3) http://www.aerzteblatt.de/archiv/160842
(4) Wruck, W., Kawala, M.-A., Graffmann, N. & Adjaye, J. (2016): Strategies for identifying predictive biomarkers of non-alcoholic fatty liver disease. http://www.drugtargetreview.com/10985/content- type/articles/strategies-identifying-predictive-biomarkers-non-alcoholic-fatty-liver-disease/
(5) Roeb E, Steffen HM, Bantel H, et al. (2015): S2k Leitlinie Nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen. Arbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen Medizinischen Fachgesellschaften e.V. (AWMF)-Register Nr. 021-025. http://www.awmf.org/uploads/tx_szleitlinien/021- 025l_S25_NASH_Nicht_alkoholische_Fettlebererkrankung_2015-01.pdf
(6) Buddecke, E. & Fischer, M. (1992): Pathophysiologie, Pathobiochemie, Klinische Chemie. Walter de Gruyer Verlag, Berlin, New York.
(7) Dongiovanni, P., Donati, B., Fares, R., et al. (2013): PNPLA3 I148M polymorphism and progressive liver disease. World J Gastroenterol 19 (41): 6969-6978. http://www.wjgnet.com/esps/
(8) Berger, C., Luda, C., Berg, T. et al. (2011): PNPLA3 (rs738409) 148M/M Homozygosität: ein genetischer Risikofaktor für hepatozelluläre Karzinome bei äthyltoxischer, jedoch nicht bei HCV- assoziierter Leberzirrhose. Z Gastroenterol 49 - P308 DOI: 10.1055/s-0031-1285579. https://www.thieme-connect.com/products/ejournals/abstract/10.1055/s-0031-1285579
(9) Mahdessiana, H., Taxiarchisa, A., Popova, S., et al. (2014): TM6SF2 is a regulator of liver fat metabolism influencing triglyceride secretion and hepatic lipid droplet content. PNAS 111/24: 8913– 8918. http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1323785111
(10) Takahashi, Y., Soejima, Y. & Fukusato, T. (2012): Animal models of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World J. Gastroenterol. 18 (19): 2300-2308.
(11) http://flexikon.doccheck.com/de/Risikostratifikation
(12) Zeisel, S. H., Da Costa, K. A., Franklin, P. D., et al. (1991): Choline, an essential nutrient for humans. FASEB Journal 5/7: 2093–2098. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2010061
(13) http://www.eurostemcell.org/de/factsheet/reprogrammierung-wie-jede-zelle-des-k%C3%B6rpers- zu-einer-pluripotenten-stammzelle-gemacht-wird
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