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Donnerstag, 04 Oktober 2012 17:05

Arbeitsgruppe im Portrait: Across Barriers

InVitroJobs stellt regelmäßig Wissenschaftler und ihre innovativen Forschungen als „Arbeitsgruppe im Portrait“ vor. Im Fokus stehen neu entwickelte Methoden, ihre Evaluation sowie der Ausblick, welche tierexperimentellen Versuchsansätze gemäß dem 3R-Prinzip (reduce, refine, replace) nach Möglichkeit reduziert und bestenfalls ersetzt werden können. In dieser Ausgabe stellen wir Across Barriers aus Saarbrücken vor.

Das Spin-off Unternehmen, eine Ausgliederung der Universität des Saarlandes, Fakultät für Pharmazie, wurde 1998 von Prof. Claus-Michael Lehr und Dr. Eleonore Haltner gegründet. Es beschäftigt mittlerweile 36 Mitarbeiter. Mit der Universität des Saarlandes verbindet das Unternehmen eine enge Kooperation.




Firmensitz von Across Barriers im saarländischen Science Park.
Foto: Across Barriers.


Across Barriers hat zum Ziel, neue in vitro-Methoden zur Charakterisierung pharmazeutischer Wirkstoffe zu entwickeln und bietet sie dann als Dienstleistung der pharmazeutischen, kosmetischen und chemische Industrie an. Das Unternehmen ist zertifiziert nach GLP (Good Laboratory Practise)1, d. h. ist zertifiziert, im nicht-klinischen Laborbereich einen hohen internationalen Qualitätsstandard anzubieten. Das Unternehmen ist außerdem GMP-zertifizert (Good Manufactory Pratice)2, was für die Pharma-, Chemie- und Kosmetikhersteller von großer Bedeutung ist. Seit 2009 hat das Unternehmen eine Zulassung der Federal Drug Association für den amerikanischen Markt.

Das Unternehmen war mehrfach Preisträger von Unternehmenswettbewerben, so z. B. des „Gründer Champion 2000“ des Bundesministeriums für Wirtschaft sowie des Wettbewerbs "Entrepreneur des Jahres 2002", ausgeschrieben von Ernst & Young.

Im Auftrag der pharmazeutischen oder chemischen Industrie nimmt Across Barriers eine physiko-chemische Charakterisierung von pharmazeutischen Substanzen vor, d. h. untersucht Parameter der zu testenden Substanz, wie deren Fett- und Wasserlöslichkeit, die Säurekonstante in Wasser, das Proteinbindungsvermögen, die Stabilität der Substanz, ferner werden die Moleküle charakterisiert (1).  Zudem wird die Verstoffwechslung der Testsubstanz mit Zellkulturen oder künstlichen Geweben in vitro untersucht. Hierfür hat das Unternehmen eine eigene Forschungs- und Entwicklungsabteilung und entwickelt innovative in vitro-Testsysteme, die den Transport von Substanzen und Formulierungen durch Barrieren simulieren und als Ersatz zu traditionellen Tierversuchen dienen.

Substanzen müssen je nach Ort der Anwendung die verschiedensten Barrieren durchwandern. Hierbei kann es sich um die Haut, die Nasen- oder Mundschleimhaut, die Hornhaut des Auges, die Darmschleimhaut, die Bronchial- oder Lungenbarriere oder die Blut-Hirn-Schranke handeln. Dabei wird einerseits untersucht, ob und wie die untersuchten Substanzen die Barriere durchdringen und, ob und wie sie dabei verändert und/oder transportiert werden. Da eine orale Aufnahme von Medikamenten z. B. Nebenwirkungen verursachen kann und die Stoffe über die Leber abgebaut oder zumindest verändert werden, bevor sie am Wirkort ankommen, entwickeln Forscher Testsysteme, die gleich am Wirkort, z. B. auf der Haut oder am Auge ansetzen. Auch für kosmetische Produkte sind diese Testsysteme von großer Bedeutung.

Um Stoffwechsel- und andere Vorgänge, wie die Penetration von Substanzen, detailliert zu untersuchen, werden humanspezifische Zell- oder Organkultursysteme oder künstliche Organe eingesetzt. Das Unternehmen Across Barriers befasst sich mit der Entwicklung solcher Systeme.

 



Auch die Nachwuchsförderung hat einen wichtigen Stellenwert bei Across Barriers.
Fotos: Manuel Sacha.


Eigene Skin-Bank und Hautmodelle
Da sich die Haut von Tieren in wesentlichen Eigenschaften von der des Menschen unterscheidet und solche Art Testergebnisse nur beschränkt auf den Menschen übertragbar wären, hat Across Barriers eine Skin-Bank entwickelt, in der menschliche Häute aus kosmetischen Operationen gelagert werden. Die menschlichen Häute werden als Vollhaut-in vitro-Modell, in Schnitten von einer Dicke von 300 bis 500 Mikrometern, in einzelnen Hautschichten oder nur die oberste Hautschicht, das Stratum corneum (die Hornschicht) in Substanztests eingesetzt.




Die menschliche Haut: Ausgangsmaterial für humane in vitro-Hautmodelle und die Skin-Bank von Across Barriers.
Foto: Antorti, iStockphoto.


Aber auch andere humane in vitro-Hautmodelle werden eingesetzt, wie EpiDerm (Patent der Firma MatTek) oder EpiSkin (SkinEthic Laboratories, Frankreich). Untersucht werden die Permeation (Durchtransport von Substanzen zu einem Akzeptorbereich) oder die Penetration (das Eindringen in die verschiedenen Hautschichten, die selbst als Akzeptorbereich dienen). Für Permeationsversuche wird die Haut in eine Franzsche Diffusionszelle3 eingespannt, für Penetrationsversuche das sogenannte „Saarbrücken-Modell“4 verwendet. Nach einer bestimmten Expositionszeit werden die Hautschichten mit einem Mikrotom (eine Schneidemaschine, die mikrometerdünne Scheiben schneiden kann) geschnitten und über UV-Detektoren, flüssigkeitschromatografisch oder massenspektrometrisch dahingehend analysiert, wo und wieviel des Wirkstoffs in die einzelnen Schichten gelangt ist. Bei den Permeationsversuchen geht es auch um die Geschwindigkeit, in der ein Stoff in die Hautschichten eindringt.


Gastrointestinales Zellkulturmodell mit Caco2-Kultur
Bei oraler Aufnahme von Arzneistoffen z. B. fungiert der Darm als entscheidende Barriere für die Aufnahme in den Blutkreislauf. Zur Untersuchung der Permeabilität, Absorption und zur Vorhersage der Bioverfügbarkeit und toxischer Effekte wird die in vitro-Zellkultur mit Caco2-Zellen eingesetzt. Die Zellkultur wurde erstmals 1977 durch Dr. Jorgen Fogh vom Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York, aus einem humanen Adenokarzinom des Colons (Dickdarms) isoliert und charakterisiert (2). Seitdem ist es vielfach optimiert und standardisiert worden, auch unter maßgeblicher Beteiligung von Dr. Eleonore Haltner und Prof. Claus-Michael Lehr (3, 4, 5, 6 ).




Ansicht eines Dünndarms mit Morbus crohn, einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung. Zur Testung neuer Medikamente gegen diese Krankheit werden Zellkultursysteme mit CaCo-2-Zellen eingesetzt.
Foto: Selvanegra, iStockphoto.


Across Barriers setzt die Zellkultursysteme z. B. zum Permeabilitätsscreening und für Untersuchungen zur Einordnung eines Arzneistoffes in das Biopharmazeutische Klassifikationssystem (BCS)5 ein. Die Klassifizierung nach BCS ist sowohl nach den amerikanischen FDA-Richtlinien als auch in einer Leitlinie der europäischen Arzneimittelagentur zur Beurteilung der Bioäquivalenz6 von Arzneimitteln vorgesehen.

Alternativ wird auch exzidierter Schweinedarm von Schlachttieren in der Ussing-Kammer7 für solcher Art Untersuchungen verwendet.


Künstliches Lungenmodell
Das künstliche Lungenmodell besteht aus Calu-3 Zellkulturen, die als Monolayer (Einzelzellschicht) in kleinen herausnehmbaren Plastikschälchen, sogenannten Transwell-Inserts,  auf einer permeablen Membran wachsen. Hier werden sie mit in Flüssigkeit gelösten Nährstoffen versorgt. Es gibt zwei Möglichkeiten der Versorgung mit Nährstoffen: entweder steht die gesamte Zellschicht unter Wasser (die traditionelle sogenannte LCC-Kultur), wobei die Nährstoffe die Zellen von oben und unten versorgen, die zweite Möglichkeit ist die moderne Air-Liquid-Interface-Kultur, bei der die Oberseite der Kultur Luft-exponiert ist. Letztere simuliert den Ablauf in der menschlichen Lunge besser, weil sie eine schichtähnliche Wuchsform entwickelt und die Zellen mehr für diese Zellen typischen Cilien und Schleim entwickeln. Die Zellen brauchen 10 Tage bis sie für den Einsatz entwickelt sind und die Zell-Zell-Verbindungen, sogenannte Tight junctions, ausgebildet haben. Diese stellen die eigentliche Barriere für perfundierende Substanzen im Lungengewebe dar. Wie es beim Einatmen von Substanzen in die Lunge auch der Fall wäre, trifft die Testsubstanz über die Luft von oben auf die Zellen auf und muss nun die Barrieren durchdringen. Across Barriers untersucht mit dieser Zellkultur die Permeabilitätskinetik (wie schnell eine Substanz in die Lungenzellen permeiren kann und welche Stoffkonzentrationsabhängigkeiten bestehen), Effluxuntersuchung (Ausstrom der Substanz aus der Zelle) oder, ob ein bestimmtes Protein (P-Glykoprotein8) durch die zu untersuchende Substanz gehemmt wird. Dieses Protein transportiert toxische Stoffe aus dem Körper, bindet jedoch auch an Arzneimittel, die dann nicht mehr wirksam werden können.





6-Well-Plate mit 5 Inserts.
Foto: Christiane Hohensee


Künstliches Corneamodell
Hoch aktuell ist ein entwickeltes künstliches Corneamodell aus humanen Zellen, das vor Kurzem auf dem Kongress für Alternativen zu Tierversuchen in Linz vorgestellt worden ist.

Bislang werden viele Tiere in Versuchen eingesetzt, in denen es um neue Medikamente zur Behandlung von Augenkrankheiten geht. Auch wird der Einfluss von Hilfsmitteln in der auf die Hornhaut des Auges aufzutragende Arznei untersucht. Für das in vitro-Modell von Across Barriers, das auch humanes Corneakonstrukt (HCC) genannt wird, wurden immortalisierte humane Hornhautepithelzellen (HCE-T Zelllinie) des Auges und eine humane Hornhautkeratinozytenzelllinie (HCK-Ca Zelllinie) eingesetzt.

Das Modell ist bereits in mehreren Laboren optimiert, evaluiert und prävalidiert worden (7, 8). Untersucht  werden die Permeabilität und die Verträglichkeit des Wirkstoffes einschließlich der Verträglichkeit von Konservierungsmitteln. Es handelt sich um einen dreischichtigen Aufbau mit einem mehrschichtigen Epithel, das die Hauptbarriereeigenschaften bei der Permeation von Substanzen durch die Zellen darstellt.


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Die Konstruktion des HCC erfolgt durch schrittweisen Aufbau in speziellen Kultivierungsgefäßen, die sowohl eine in Medium untergetauchte Kultivierung  auch eine Züchtung an der Luft-Medium-Grenze ermöglichen. Hierbei wird ein Polycarbonatfilter mit einem azellulären Kollagengel beschichtet, auf das Endothelzellen aufgebracht werden. Der Endothel-Monolayer wird mit einem Kollagengel, das stromale Fibroblasten enthält, überschichtet und submers kultiviert. Nach der Kontraktion des Stromaäquivalents werden corneale Epithelzellen aufgesät und bis zur Konfluenz  (dichtest mögliche Anordnung) submers kultiviert. Sodann wird der Mediumspiegel etwas gesenkt und die Konstrukte mit Hilfe einer Metallplatte angehoben. Nach mehrtägiger Kultivierung an der Luft-Medium-Grenze bildet sich ein mehrschichtiges Epithel. Die Gesamtkultivierung des HCC dauert vier Wochen (9, 10).
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Hornhautepithelzellen HCE-T zu 95% konfluent (20x Vergrößerung). Konfluenz ist die dichtest mögliche Anordnung von an der Oberfläche anheftenden Zellen des Kulturgefäßes.
Foto: Gustavo Guzman, Across Barriers.




Hornhautkeratinozytenzellinie: HCK-Ca Zellen zu 95% konfluent (20x Vergrößerung).
Foto: Gustavo Guzman, Across Barriers.


Zur Herstellung des HCC-Modells werden transformierte humane Zelllinien verwendet. Dabei werden die Zellen meistens mit SV 40-Viren „transfiziert“ oder das entsprechende Gen für das SV 40 large-T-Antigen eingebracht. Hierdurch werden sie beinahe unbegrenzt kulturfähig (immortalisiert), ohne ihre Eigenschaften zu verlieren (9, 10).

Um die Permeabilität der entwickelten Zellkultur zu erfassen, wird u. a. der sogenannte transepitheliale elektrische Widerstand (TEER)9 untersucht. Der ist ein guter Biomarker, denn bei Entzündungen beispielsweise wird der Widerstand herabgesetzt und die Barriere wird durchlässiger. In diesem Falle wurde die Verträglichkeit und die Unverträglichkeit der dem Wirkstoff beigemischten Konservierungsmittel ausgesagt (7).


Blut-Hirn-Schranke
Bei einer medikamentösen Therapie des Zentralnervensystems müssen Substanzen erst die Blut-Hirn-Schranke passieren, um am Wirkort aktiv werden zu können. Im Unterschied zu wasserlöslichen Substanzen können fettlösliche Substanzen die Blut-Hirn-Schranke passieren und vom Blut in das Gehirn übertreten. Über Carrier (Tunnelproteine) in der Membran ist die Blut-Hirn-Schranke auch aktiv am Stoffmetabolismus beteiligt, weil transportierte Moleküle zusätzlich chemisch verändert werden (11). Um daher die Permeabilität von Stoffen durch die Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen, hat das Unternehmen Across Barriers ein in vitro-Modell etabliert und standardisiert. Es basiert auf Endothelzellen von Hirnkapillaren des Schweins, stellt deshalb im Moment noch kein vollständiges Ersatzverfahren zum Tierversuch dar. Es soll das Bindeglied zwischen Daten aus dem Tierversuch mit Computer-Vorhersagemodellen verbinden. Da die Blut-Hirn-Schranke nicht einfach zu überwinden ist, sind Transportstudien hierzu von großer Bedeutung. Nicht nur Substanzen können getestet werden, die die Blut-Hirn-Schranke überwinden sollen, sondern auch solche, die daran gehindert werden sollen, diese Barriere zu überwinden. Die Zellen werden auf einer Polycarbonatmembran in einem Transwell-System einschichtig herangezogen. Nach sieben Tagen lässt sich die Testsubstanz darauf geben. Die Permeabilität wird per HPLC10 analysiert und quantifiziert.


Künstliches Fingernagelmodell
Das künstliche Fingernagelmodell wird eingesetzt, um mögliche Medikamente, die z. B. gegen Nagelpilz entwickelt werden, zu testen. Fingernägel bestehen aus einer speziellen Form von Keratin und nicht aus lebenden Zellen und können daher derzeit nicht anderweitig mit den nötigen Eigenschaften künstlich gezüchtet werden. Da menschliche Fingernägel auch mengenmäßig nicht zur Verfügung stehen, haben die Wissenschaftler ein Modell entwickelt, dass die Klauenhaut von Rindern aus dem Schlachthof verwendet.

Alle in vitro-Modelle haben u. a. zum Ziel, den Tierversuch zu ersetzen und, wo es technisch bereits möglich ist, humanspezifisches Material zu verwenden.


InVitroJobs führte ein Interview mit der Geschäftsführerin und Gründerin von Across Barriers, Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu.

InVitroJobs: Across Barriers: wie sind Sie auf den Namen gekommen?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Der Name leitet sich von unserer Tätigkeit ab. Die Tätigkeit der Across Barriers besteht darin, dass wir den Arzneistoff-Transport durch biologische Barrieren erforschen. Als wir die Idee für den Namen bekamen, haben wir an der Universität bei Studenten eine kleine Umfrage gestartet. Studenten aus dem naturwissenschaftlich-pharmazeutischen Bereich haben die richtigen Schlüsse aus den Namen gezogen, sie brachten den Namen mit Absorption in Verbindung. Bei Studenten aus nicht-naturwissenschaftlichen Bereichen wurde der Name mit Menschenrechtsorganisationen, z. B. mit Kommunikation, in Verbindung gebracht, was uns wichtig war. In allen Fällen war der Name positiv belegt und erweckte keine negative Assoziationen.

Invitrojobs: Wie waren die Gründerzeiten in einem Unternehmen, dass sich auf Ersatzverfahren zum Tierversuch spezialisiert hat?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Am Anfang war es sehr schwierig, weil die Methoden, mit denen wir gearbeitet haben, noch nicht offiziell anerkannt waren. Das bedeutet, dass die Industrie die Methoden vorsichtig anwendete, aber nur im Forschungsbericht veröffentlichte. Es musste daher noch für die Akzeptanz der Methoden gesorgt werden.

Invitrojobs: Sie arbeiten unter drei GLP-Kategorien: welche Kategorien sind das?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Die drei GLP Kategorien sind 1, 8 und 9. Dies bedeutet die Zulassung für: analytische Arbeiten, physiko-chemische Untersuchungen und für in vitro-Tests auf Basis von Zell- und Gewebeuntersuchungen.

Invitrojobs: Das Unternehmen hat sich bei der Standardisierung der Caco-2-Zellsysteme stark engagiert: Was waren dabei die wichtigsten Stationen? Was können Sie uns über die Entwicklung sagen?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Die wichtigste Station war zunächst zu versuchen, ein standardisiertes Versuchsdesign zu entwickeln, um in unserem eigenen Labor reproduzierbare Daten mit einer geringen Standardabweichung zu erheben. Der zweite Schritt war, entsprechend den Empfehlungen der FDA (BCS, bioclassification system5) die Qualifizierung der Zellen gemäß der FDA-Vorgaben mit 19 Substanzen durchzuführen. Es folgte die Kooperation mit anderen Unternehmen und auch mit der FDA um festzustellen, wie gut das Zellmodell von einem Labor auf  das andere zu übertragen war und wie reproduzierbar die Daten zwischen den unterschiedlichen Laboren waren. Dabei wurden verschiedene Einflussgrößen ermittelt wie z. B der Einfluss des Puffers oder der Einfluss des pH-Wertes. Es wurde ebenfalls ermittelt, dass nicht die Werte der Meßdaten aus verschiedenen Laboren im absoluten Sinne verglichen werden können sondern dies  anhand einer sogenannten Kalibrationskurve erfolgt, wie sie heute auch in der BCS Guideline der FDA beschrieben ist.

Invitrojobs: Die Caco-2-Zellen stammen doch eigentlich vom Dickdarm: weshalb sind sie dann z.B. für Penetrationsstudien oder Resorptionsstudien des Dünndarms geeignet? Dickdarm- und Dünndarmzellen haben doch unterschiedliche Aufgaben und müssten doch dann auch unterschiedliche Rezeptoren o. ä. haben?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Es ist ein purer Zufall. Die Caco-2 Zellen wurden im Jahr 1947 von Fogh entdeckt. Herr Fogh hat über 100 verschiedene Krebszellen aus dem Darm untersucht und dabei auch die Caco-2 Zellen entdeckt. Bei einer späteren Charakterisierung stellte sich dann heraus, dass sie, obwohl sie aus einem Dickdarm-Karzinom stammen, den Enterozyten des Dünndarms weitaus ähnlicher sind. Das bedeutet, sie bilden einen dichten Monolayer und exprimieren die entsprechenden Transportsysteme, die auch im Dünndarm exprimiert werden. Deswegen haben sich die Caco-2 Zellen auch als Zellmodell zur Untersuchung der Absorption aus dem Dünndarm durchgesetzt.

Invitrojobs: Ist es nicht schwierig, Darmkrebszellen wie einst die Caco-2-Zellen in zuverlässig funktionierende Zellkulturen umzufunktionieren? Es waren doch mal entartete Zellen?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Der Vorteil einer Krebszelllinie ist der, dass sie nicht mehr umfunktioniert werden muss. Sie hat bereits bestimmte Eigenschaften und muss nicht weiter transfiziert werden (Anm. Red. "Transfektion": Einbringen von Fremd-DNA oder RNA in eukaryotische Zellen), um sie unsterblich zu machen, weil sie schon von Haus aus unsterblich ist und daher leicht im Labor gezüchtet werden kann. Natürlich verhält sich die Caco-2 Zelllinie wie jede andere Krebszelllinie, sie verändert sich mit der Dauer der Kultur. Hier die Einflussfaktoren zu ermitteln, die zur Veränderung führen und die Kultur im Labor entsprechend zu führen, gehört eben dann mit zur Standardisierung eines Zellmodells auf Basis von Krebszellen. Anhand eines einfachen Beispiels lässt sich das verdeutlichen: Caco-2 Zellen verlieren unter unseren Kulturbedingungen nach 40 Wochen ihre ursprüngliche Eigenschaft. Deswegen züchten wir alle 35 Wochen eine neue Kultur heran, die wir vollständig charakterisieren und erst dann wieder in Versuchen einsetzen.

InVitroJobs: Wie ist der Stand der Entwicklung? Kann man abschätzen, ob und wann das Modell vielleicht validiert wird?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Das okulare Modell wurde im Rahmen eines BMBF-Projektes prävalidiert nach den entsprechenden Vorgaben der ECVAM. Wir setzen mittlerweile das Modell  in Untersuchungen im Forschungsbereich ein und würden es sehr gerne nach den entsprechenden Regeln validieren Allerdings sind Validierungsstudien extrem aufwändig und werden in der Regel nicht finanziert. Das bedeutet, man bekommt keine finanziellen Mittel vom BMBF oder auch über EU-Projektförderungen, um derartig aufwändige Untersuchungen machen zu können. Daher ist es sehr unwahrscheinlich, dass wir das Modell entsprechend den Vorgaben mit Partnern validieren können, weil die Kosten von einem mittelständischen Unternehmen, aber auch von Universitäten nicht getragen werden können. Wir gehen mit diesem Modell genauso vor wie beim Caco-2 Modell, das offiziell nie validiert worden ist, indem wir weiter mit dem Modell arbeiten, weitere Untersuchungen zu Reproduzierbarkeit und Aussagefähigkeit auf eigene Kosten durchführen, die Ergebnisse dann auch publizieren und hoffen, auf diese Art und Weise die Akzeptanz A) bei unseren Kunden und B) bei den Behörden gewinnen zu können.

InVitroJobs: Im Moment wird noch Kollagen von der Ratte zur Herstellung des Kollagengels eingesetzt, in das dann die humanen Cornea-Keratinozyten eingebracht werden. Gibt es hierfür in absehbarer Zeit keinen Ersatz aus humanem Material?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Auf der einen Seite wäre es sicherlich wünschenswert, ein rein humanes Modell zu haben und daher auch das tierische Kollagen durch humanes Kollagen zu ersetzen. Auf der anderen Seite wäre der Nachteil bei diesem Ansatz unter Umständen die Verfügbarkeit dieses humanen Materials. Wenn ein Modell weltweit als Ersatz für häufig durchgeführte Tierversuche einsetzt werden soll, ist es auch wichtig, dass alle Bestandteile, die sich im Modell befinden wie dieses Beispiel Kollagen, in ausreichender Menge und gleichbleibender Qualität zur Verfügung steht, was bei humanem Material immer schwierig ist und auch an ethische Grenzen stößt. Viel interessanter wäre es zu versuchen, Kollagenstrukturen durch andere Gele zu ersetzen, die entweder auf pflanzlicher Basis oder auf Polymerbasis gewonnen werden, weil diese Materialien dann in großen Mengen zu Verfügung stehen würden.

InVitroJobs: Wie wird das Problem gelöst, dass beim Draize-Test auch die Augenbindehaut auf Entzündung oder Beschädigung mit getestet wird?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Im Moment ist dies noch völlig ungeklärt, das sind dann die nächsten Schritte. Das Modell ist zunächst aufgebaut worden, um die Permeation von Arzneistoffen und Irritationen an der Cornea zu untersuchen. Es gilt zunächst abzuklären, ob die Bindehaut aus ähnlichen Zelltypen besteht und deswegen auch dieses Modell eingesetzt werden kann oder, ob ein weiteres Modell zur Bindehaut aufgebaut werden muss.

InVitroJobs: Ist es denkbar, auch ein Blut-Hirn-Schranken-Modell aus humanen Endothelzellen zu entwickeln? Arbeiten Sie daran?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Es ist sehr schwierig, Endothelzellen in Kultur zu bringen. Wir gewinnen die Endothelzellen momentan aus Schweinehirn-Kapillaren, da diese Tiere aus anderen Gründen sowieso getötet werden. Zwingend notwendig ist es, die Kapillaren aus dem Gehirn absolut frisch zu gewinnen, das heißt zwischen der Tötung des Tieres und dem Gewinn der Endothelzellen dürfen nur zwei Stunden vergehen. Daher ist es völlig ausgeschlossen, auf Basis von Primärzellen ein derartiges Modell aus humanem Material aufzubauen. Die einzige Möglichkeit wäre, unter Umständen Stammzellen zu verwenden und diese so zu differenzieren, dass sie sich wie  kapillare Endothelzellen aus dem Gehirn verhalten.

InVitroJobs: Für einige der in vitro-Verfahren bieten Sie noch Untersuchungen mit Zell- oder Gewebematerial von Tieren, z. B. primäre Alveolarzellen des Schweines ein. Wird das von den Auftraggebern noch gefordert? Beabsichtigen Sie, das nach und nach ganz auf humanspezifisches Gewebe umzustellen?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Auf der einen Seite wäre es sehr wünschenswert, da wir Untersuchungen mit Substanzen machen, die am Menschen angewendet werden sollen. Auf der anderen Seite gibt es bei der Umstellung auf humane Modelle immer das Problem der Verfügbarkeit des Gewebes. Daher wird es sehr schwierig, Versuche zu ersetzen, wenn es immer wieder am Gewebe mangelt. Aus Leichengewebe kann sehr häufig nicht der entsprechende Zelltyp isoliert werden. Ein Weg ist unter Umständen in Zukunft, derartige Modelle über Stammzellen zu etablieren. Momentan werden für humane Zellmodelle sehr häufig Materialien aus Biopsien eingesetzt, aber auch hier stellt sich die Frage, inwieweit dieses Material repräsentativ für einen gesunden Menschen ist.

InVitroJobs: Was haben Sie für Erfahrungen im Vergleich zwischen Zell- und Gewebekulturen humanen oder tierischen Ursprungs?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Wir haben durchaus schon Modelle, die auf tierischen Zellen beruhen, mit Modellen verglichen, die auf humanen Zellen beruhen. Ein Beispiel ist das Modell der Alveolarzellen, das heißt der Lunge: Bei Across Barriers arbeiten wir mit porcinen Alveolarzellen und der Lehrstuhl meines Doktorvaters Prof. Lehr hat in der Vergangenheit mit humanen Zellen der Lunge gearbeitet, die aus Biopsien erhalten wurden. Wir haben bezüglich der Fragestellungen der Absorption beide Modelle verglichen und konnten keinen Unterschied feststellen.

Invitrojobs: Einige Ihrer in vitro-Modelle betreffen den Endpunkt „repeated dose“, also wiederholte Anwendung, die auch bei der Entscheidung über die Aufrechterhaltung des Verkaufsverbots von an Tieren getesteter Kosmetik eine Rolle spielen. Für dieses Studienziel soll es am schwierigsten sein, ausreichend Ersatzverfahren zu finden. Wie denken Sie darüber?

Dr. Eleonore Haltner-Ukomadu: Es ist in der Tat richtig, dass es anhand von in vitro-Modellen, die auf Geweben oder Zellen basieren, extrem schwierig ist, repeated dose-Untersuchungen zu machen. Sehr viele Zellkulturmodelle haben nur eine Lebensdauer von wenigen Tagen und können daher für repeated dose-Untersuchungen nicht eingesetzt werden. Daher ist es noch ein sehr aufwändiges Ziel. Allerdings gibt es auch schon Beispiele von Langzeit-Zellkulturen, wo Zellen ohne Veränderung ihre Eigenschaften über mehrere Monate bis hin zu einem Jahr Züchtung beibehalten haben. Zum Beispiel ist das schon für Lungenzellen möglich. Außerdem arbeiten wir auch als Unternehmen an Projekten, um dies zu realisieren. Ein Ansatz dazu ist, Zellkulturen in microfluidic Chips zu etablieren, weil in diesen Systemen auf der einen Seite notwendige Scherkräfte erzeugt werden können und auf der andere Seite der Ernährungsstatus der Zellen wesentlich besser ist. Man vermutet, dass dadurch die Lebensdauer der Zellen erhöht werden kann. Dies wiederum ist die Grundvoraussetzung, um repeated dose-Untersuchungen vornehmen zu können.

InVitroJobs: Wir danken für das Gespräch.



Glossar:

1 GLP: Laboratorien, die nicht-klinische gesundheits- und umweltrelevante Sicherheitsprüfungen von Stoffen oder Zubereitungen vornehmen, müssen diese unter Einhaltung der Grundsätze einer Guten Laborpraxis (GLP) durchführen, wenn die Ergebnisse der Sicherheitsprüfungen eine Bewertung der möglichen Gefahren der Stoffe oder Zubereitungen für Mensch und Umwelt durch die Bundesoberbehörden in einem Zulassung-, Erlaubnis-, Registrierungs-, Anmelde- oder
Mitteilungsverfahren ermöglichen sollen.   http://www.lgl.bayern.de/das_lgl/aufgaben_zustaendigkeiten/zqm_aufgaben/glp_informationen.htm
2 good manufactory practise: Richtlinien zur Qualitätssicherung der Produktionsabläufe und -umgebung in der Produktion von Arzneimitteln, Wirkstoffen, aber auch bei Kosmetika, Lebens- und Futtermitteln. (http://de.wikipedia.org/wiki/Good_Manufacturing_Practice)
3 Franzzelle oder Franz´sche Diffusionskammer: Die Franz´sche Diffusionskammer ist ein aus zwei  Teilen bestehendes in vitro-Testsystem für den Test einer Wirkstoffdiffusion.  Es besteht aus einem Donor-Kompartment und einem Empfänger-Kompartment, getrennt durch eine künstliche Membran,  eine rekonstruierte  oder exzisierter Haut.  Wirkstoffformulierungen werden auf das Donor-Kompartment aufgetragen, die Proben werden nach Diffusion durch die Membran oder Haut in zuvor bestimmten Intervallen aus dem Empfänger-Kompartment entnommen.
4 Saarbrücken-Modell:  auch Saarbrücken-Penetrationsmodell, die Wirkstoffmenge innerhalb der obersten Hautschicht (Stratum corneum) lässt sich mit Hilfe dieser Apparatur in einzelnen Corneozyten-Zellsschichten ermitteln, indem sie mithilfe von Klebestreifen von der Schicht heruntergelöst und diese Tape-strips in eine Messapparatur überführt werden. Unnatürliche Befeuchtungen der Haut wird vermieden, im Gegensatz zur Franz´schen Diffusionszelle ist die Haut das Empfänger-Kompartiment.
5 Biopharmazeutisches Klassifizierungssystem (BCS): Arzneimittel werden in vier Klassen eingeteilt je nach Löslichkeit und Permeabilität (http://www.fda.gov/AboutFDA/CentersOffices/OfficeofMedicalProductsandTobacco/CDER/ucm128219.htm)
6 Bioäquivalenz: Der Begriff stammt aus der Pharmakokinetik und bewertet die Austauschbarkeit zweier wirkstoffgleicher Arzneimittel, die sich jedoch im Herstellungsprozess und/oder bei den enthaltenen Hilfsstoffen unterscheiden (http://de.wikipedia.org/wiki/Bio%C3%A4quivalenz).
7 Ussing-Kammer: Eine Ussing-Kammer ist eine elektrophysiologische Apparatur zur (typischerweise stundenlangen) Zellkultur von Epithelien und Messung von Barriere- und Transportfunktionen des lebenden Gewebes. (http://www.fh-jena.de/~gitter/ussikamr.pdf)
8 P-Glykoprotein: Das P-Glykoprotein hat für den Körper eine wichtige Schutzfunktion, da es potenziell toxische Stoffe aktiv aus der Zelle transportiert. Auf diese Art kann es aber auch die wirksame Behandlung von Krankheiten verhindern, denn viele Arzneistoffe sind Liganden des P-Glykoproteins. (http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=41568)
9 Transepithelial electrical resistance (TEER):  Die Barrierefunktion des Epithels wird durch Messung des elektrischen Widerstands über dem Epithel (transepithelialer Widerstand, englisch: transepithelial resistance = T E R ) bestimmt. Der transepitheliale Widerstand Repi wird auf die Epithelfläche bezogen und hat daher üblicherweise die Einheit Ω ⋅ cm2. Wenn das Epithel aktiv Ionen von einer zur anderen Seite bewegt (elektrogener Transport), entsteht ein transepithelialer Strom. (http://www.fh-jena.de/~gitter/ussikamr.pdf)
10 HPLC (High Performance Liquid Chromatography): ist ein Flüssigchromatografie-Verfahren, mit dem man nicht nur Substanzen trennt, sondern diese auch über Standards identifizieren und quantifizieren kann. (http://de.wikipedia.org/wiki/Hochleistungsfl%C3%BCssigkeitschromatographie)


Literatur/Quellen:

(1) http://www.uni-saarland.de/fak2/komm/_doc/profil_acrossbarriers_en.pdf
(2) Braun, J. S. (2007): Arzneistoffabsorption in Caco-2/TC7 Zellen: Ibuprofen und derMonocarboxylat-Transporter 1 (MCT1). Dissertation an der Universität Tübingen. http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/volltexte/2007/3033/pdf/Dissertation_Jutta_Braun.pdf
(3) Haltner, E., Schmitz, S., Gindorf, C. & Ruoff, J. (2001): In vitro Permeabilitätsuntersuchungen als Ersatz für Tier- und Humanstudien - welche Voraussetzungen müssen erfüllt sein? ALTEX 1/01 (http://www.altex.ch/en/index.html?id=50&iid=59&aid=31&PHPSESSID=54b804e9282565bb678e9ba279fd4952)
(4) Bock, U., Flötotto, T. & Haltner, E. (2004): Validation of cell culture models for the intestine and the blood brain barrier and comparison of drug permeation. ALTEX 2004; 21 Suppl 3: 57-64. (5) Gindorf, C., Steimer, A., Lehr, C.-M., Bock, U., Schmitz, S. & Haltner, E. (2001): Markertransport über biologische Barrieren in vitro: Vergleich von Zellkulturmodellen für die Dünndarmschleimhaut, die Blut-Hirn-Schranke und das Alveolarepithel der Lunge. ALTEX 18: 155-164.
(6) Bock, U., Kottke, T., Gindorf, C. & Haltner, E. (2003): Validation of the Caco-2 cell monolayer system for determining the permeability of drug substances according to the Biopharmaceutics Classification System (BCS).(http://www.acrossbarriers.de/uploads/media/FCT02-I-0305_BCS.pdf)
(7) Bock, U., Haltner, E., Guzman, G. & Reichl, S. (2012): Characterisation of Human Cornea Constructs for the Rapid Screening of Preservatives and Evaluation of Their Use in Permeability Assays to Reduce Animal Testing. Abstract zum Kongress für Alternativen zu Tierversuchen, Linz.
(8) Guzman, G., Reichl, S., Bock, U. & Haltner, E. (2012): Optimisation of Human Cornea Constructs For a Rapid Characterisation of Pharmaceutical Preparations, Excipients and Chemical Compounds.  Abstract zum Kongress für Alternativen zu Tierversuchen, Linz.
(9) Reichl, S. &  Müller-Goymann, C. C. (2004): Künstliche Hornhaut als In-vitro-Modell. http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=titel_20_2004
(10) Reichl, S., Bednarz, J., C C Müller-Goymann, C. C. (2004): Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. Br J Ophthalmol. 88: 560–565.
(11) Bock, U. & Haltner, E. (2003): Porcine Cerebral Capillary Endothelial Cells to study Blood-Brain Barrier Permeability. http://www.acrossbarriers.de/uploads/media/FCT01-I-0305_BBB.pdf